Les petits secrets du séquençage de l’ADN

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La société Illumina Inc, leader mondial des machines de séquençage de l’ADN (capitalisation au NASDAQ 20 milliards de dollars), utilise une technique ultra-secrète de diffusion des fragments d’ADN préalablement modifiés avec des marqueurs fluorescents au travers d’une membrane dont la composition n’est même pas totalement révélée dans les divers brevets qui protègent cette invention. Mais il n’y a pas que Illumina, associée à des équipes de biologistes et de chimistes de l’Université de l’Etat de Washington qui a eu à peu près la même idée. Un start-up anglaise travaillant en étroite collaboration avec l’Université d’Oxford – Oxford Nanopore Technologies – a développé le même type de membrane ressemblant, malgré son caractère secret, à celle mise au point par Illumina.

Comme on pouvait s’y attendre, car les enjeux économiques sont gigantesques dans le domaine du séquençage des acides nucléiques (ADN et ARN), il y a eu une bataille juridique acharnée devant la Commission américaine du commerce international (US International Trade Commission) pour tenter de trouver une solution à ce problème qui dépasse de loin la compétence des juges. La question était de savoir qui copie l’autre. Les juges se sont contenté d’apporter une réponse évasive en se référant à une doctrine juridique dite des « équivalents », en d’autres termes les deux techniques sont presque les mêmes, mais pas tout à fait, et peuvent donc faire l’objet de protections industrielles séparées.

Pour la plus grande satisfaction intellectuelle de tous les utilisateurs de machines de séquençage le voile du secret a donc été levé par Oxford Nanopore. Il s’agit d’une membrane dont les nanopores sont tapissés par une protéine en forme de tube que l’on retrouve chez toutes les bactéries et qui sert à contrôler l’entrée de macromolécules à l’intérieur de ces bactéries. Cette protéine est appelée comme il se doit une « porine ». La différence entre les technologies de ces deux compagnies est que l’une (Illumina) a opté pour une porine de mycobactérie alors que l’autre (Oxford nanopore) a choisi une porine d’Escherichia coli. Le souci est que ces protéines sont très proches au niveau structural – leur séquence d’aminoacides – et les juges ont conclu que les problèmes seraient résolus si les porines utilisées ne présentaient pas plus de 68 % d’homologie de structure. On appelle ça couper la poire en deux.

Ce que l’on ne connait toujours pas est la modification de l’enchainement des aminoacides de ces porines produites par génie génétique afin qu’elle transmettent correctement un signal électrique quand les brins d’ADN (ou d’ARN) les traversent. Et c’est sur ce point particulier que le secret est jalousement gardé par Oxford nanopore car une machine de séquençage doit être fiable à plus de 95 %. Les juges américains se sont déclarés incompétents et il est facile de le comprendre compte tenu de la complexité de cette technologie.

Bref, nul ne sait si Oxford nanopore supplantera un jour Illumina grâce à sa nouvelle technique initialement développée (Brevet US 20140186823 A1 que je conseille aux curieux de lire) par un laboratoire belge mais la bataille juridique est terminée et il faut souhaiter que chaque société réalise des bénéfices calmement.

Source : Science magazine, illustration Oxford nanopore : une porine à l’intérieur de laquelle passe un fragment d’ADN mono-brin.

Diagnostiquer à coup sûr la présence d’un virus dans un prélèvement sanguin : l’affaire de quelques heures.

Il y a quelques semaines le Docteur Ian Lipkin, spécialiste des diagnostics à l’école de médecine de l’Université Columbia a eu une grosse surprise. Son laboratoire a reçu un échantillon de sang d’un patient de l’hôpital universitaire pour analyse car les médecins ne comprenaient pas de quelle maladie mystérieuse souffrait ce malade, un genre de fièvre hémorragique. Comme quelques temps auparavant Lipkin avait découvert un nouveau virus apparenté à celui de la polyomyélite à l’aide des techniques d’analyse qu’il avait développé dans son laboratoire et que les symptomes du patient d’alors ressemblaient étrangement à ceux décrits pour ce nouveau patient, il préféra ne pas prendre de risques et effectua l’analyse du sang de ce patient. Il identifia immédiatement le virus comme étant celui de la dengue, une fièvre hémorragique. Une brève enquête révéla que le patient avait séjourné au Viet-Nam quelques mois auparavant. Comme il était sous traitement immunodépresseur pour recevoir une greffe de moëlle osseuse, le virus de la dengue réapparut.

Cette histoire n’aurait aucun intérêt si on ne se penchait pas sur la technologie innovante mise au point par Lipkin. Il a adapté la technique dite PCR (Polymerase Chain Reaction) pour effectuer des diagnostics à haute fréquence. La PCR consiste à amplifier le nombre de copies d’un morceau d’ADN présent dans un échantillon afin d’en déterminer ultérieurement la séquence avec une machine de séquençage automatique Illumina (voir le lien):

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Pour être certain de ce que l’on veut amplifier, il est nécessaire de connaître le petit morceau d’ADN qui sert à amorcer la réaction (DNA primer) et plus ce morceau comporte de bases (A, T, G et C) plus la spécificité de la PCR est élevée. Il existe maintenant des millions d’amorces disponibles commercialement et Lipkin, n’ayant pas froid aux yeux, on peut dire les choses ainsi, a réalisé une gymnastique incroyable en ajoutant dans le milieu réactionnel les amorces – un peu plus de deux millions – correspondant à pas moins de 502 virus pathogènes pour les mammifères dont l’homme. Il a fait le pari que comme les virus ont tendance à muter sans arrêt une amorce suffisamment longue ne s’apariant pas parfaitement avec un acide nucléique pourrait tout de même fonctionner correctement. Passons sur la préparation des échantillons car beaucoup de virus ont un matériel génétique constitué d’ARN qu’il faut transformer en ADN par une opération maintenant routinière et il faut éviter que l’ADN soit malencontreusement détruit par des activités enzymatiques indésirables présentes dans l’échantillon analysé.

Bref, une fois cette amplification par PCR terminée le mélange est analysé dans un séquençeur automatique et le tour est joué. Sans entrer dans les détails complexes de la technique développée par Lipkin la spécificité, les faux-positifs et le traitement des échantillons ont été optimisés ainsi que le logiciel d’analyse des résultats du séquençage pour atteindre des résultats rapides et fiables car souvent, en milieu hospitalier la vie d’un malade peut dépendre de la rapidité d’un diagnostic. Lipkin a appellé sa technologie VirCapSeq-VERT ou plateforme de séquençage de virome de vertébrés, virome signifiant la population de virus rencontrés seulement chez les mammifères. N’importe quel échantillon biologique peut être analysé en toute confiance pour un prix relativement modique de l’ordre de 60 dollars, le système automatisé permettant d’analyser en parallèle jusqu’à 21 échantillons. Belle avancée dans le diagnostic clinique !

Source : http://mbio.asm.org/ Illustration PCR : Wikipedia

http://www.illumina.com/systems/sequencing-platform-comparison.html?sciid=2014107IBN2

Où sont les start-up françaises dans le gros business du séquençage de l’ADN ?

La société Illumina (USA), partie de rien en 1998, a généré un chiffre d’affaire de 1,42 milliard de dollars en 2013 en produisant des séquenceurs qui en moins d’une semaine vous rendent sur un CD-ROM la totalité de vos informations génétiques pour la modique somme de 4000 dollars. Franchement j’avoue à mes lecteurs que je suis prêt à me soumettre à une telle analyse ne serait-ce que pour confirmer ce que me disait un vieux médecin australien qui ne cessait de me répéter : « toi, avec toutes les maladies que tu as eu, tu es blindé ». Parce que notre passé sanitaire s’inscrit dans nos gènes, ne serait-ce que pour rediriger la synthèse permanente de nos anticorps, ou encore parce je suis un buveur incorrigible de bière bas de gamme (j’en bois tellement que je me limite au bas de gamme) mon foie produit en permanence et en prévention l’alcool déshydrogénase nécessaire pour prendre en charge cet alcool, et pas seulement, cet alcool oblige mon organisme à faire en sorte que mon organisme, toujours mon foie, ne redirige pas tout l’acétate provenant de cet alcool pour en faire du mauvais gras.

Toute cette modification que j’ai imposé à mon organisme pour prendre en charge de manière subtilement balancée mes nombreux vices est maintenant inscrite dans mes gènes, au moins ceux des cellules de mon foie, mais ce qui est excitant c’est que ces modification épigénétiques se retrouvent dans le moindre prélèvement sanguin. Et pour 4000 dollars j’aimerais connaître quelles sont ces modification épigénétiques que j’ai à la longue, avec toutes les habitudes malsaines que j’ai accumulé au cours de mon existence, imprimé dans mon ADN. Peu ou prou on en est tous au même point à partir d’un certain âge, notre passé nous a irréversiblement modifié dans la profondeur de nos gènes et s’offrir un séquençage avec en prime un rapport détaillé de ce qui va encore bien et de ce qui peut créer quelque soucis constitue au moins pour un esprit curieux un véritable attrait.

Illumina s’est engagé depuis son rachat par Hofmann-Laroche en 2012 pour 6,8 milliards de dollars à procéder au séquençage total d’un individu pour la maintenant modique somme de 1000 dollars. Et comme il y a certainement des millions de curieux comme moi, il y a beaucoup d’argent à gagner et l’un des fondateurs de Facebook vient d’investir dans une start-up dont le projet osé est de fabriquer un séquenceur d’ADN de la taille d’un petit ordinateur portable, rien que ça. Yuri Milner sait de quoi il parle puisqu’il a investi un gros paquet de dollars dans GenapSys qui va fabriquer des séquenceurs miniaturisés qui n’auront rien à voir avec ceux d’Illumina qui coûtent un million de dollars pièce sans compter les consommables, c’est-à-dire les enzymes et les réactifs nécessaires pour que la machine fonctionne correctement. Avec cette machine miniaturisée de quelques milliers de dollars, le client pourra réaliser le séquençage de toute sa famille et de quelques amis pourvu qu’ils participent à l’achat des réactifs dont le prix pour chaque opération est sensiblement égal à la moitié du prix d’achat de la machine elle-même.

On en est en quelques années arrivé au même point qu’avec les imprimantes qui coûtent à l’achat une poignée de cacahuètes mais dont le prix des consommables est hors de prix, je veux parler des cartouches diverses d’encres de diverses couleurs.

Le principe de base de ce séquenceur d’un type nouveau réside dans le fait qu’un système innovant de détection des « bases » de l’ADN en cours d’étude ne les identifie qu’en mesurant un courant électrique spécifique de chaque base ce qui est le secret de l’efficacité de ce nouveau dispositif. Les autres fabricants de séquenceurs sont à l’affut, que ce soient Illumina, Ion Torrent ou Nanopores car l’arrivée sur le marché de cette nouvelle technologie rendra inévitablement obsolète celle largement développée actuellement. Même le Scripps Institute supporte ce projet, c’est dire à quel point il est prometteur. Il faudra cependant payer au final les services d’un site dédié pour l’analyse informatique des données recueillies à la fin du séquençage afin de mettre en ordre les résultats et obtenir une image cohérente de notre ADN, et ce genre de service est loin d’être gratuit car il fait appel à des capacités de calcul coûteuses.

Illumina a encore de beaux jours devant elle en équipant d’audacieux laboratoires privés qui proposent toujours pour environ 4000 dollars (y compris la localisation de vos SNP et RFLP personnels) la séquence complète de votre ADN. Avec ce service vous n’aurez pas besoin de payer quelques centaines de dollars supplémentaires pour connaître ce qui ne va pas chez vous, je veux dire dans vos cellules, et à quelle mort vous êtes condamné, mais l’ordinateur ne vous donnera ni la date ni l’heure de votre mort. C’est au moins rassurant … Ce qui est moins rassurant, c’est qu’à n’y pas manquer, les politiciens (qui n’y connaissent rien comme chacun sait) vont se mêler de ce nouvel engouement et légiféreront à tort et à travers sous prétexte que ce type de renseignement personnel est (ou peut être) contraire à l’éthique élémentaire.

Inspiré d’un article paru dans Forbes