Quelques mémoires de ma carrière de chercheur en biologie (4)

Le cas d’un fongicide (deuxième partie de cette rubrique, relire le billet du 3 novembre 2018)

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Durant plus d’un mois je passais donc mes journées à lire cette énorme bibliographie relative à l’Iprodione et il me restait enfin une dizaine d’articles, tous émanant de laboratoires universitaires sans aucun lien avec la société propriétaire de la molécule et n’ayant bénéficié d’aucun aide financiaire de cette dite société au sein de laquelle je poursuivais mes travaux, il faut le préciser. j’avais noté les observations relatant l’éclatement des cellules du champignon au cours de sa croissance mais le fongicide n’avait pas d’effet sur les spores. Le mécanisme d’action de la molécule se mettait donc en jeu quand il y avait une activité métabolique puisque les spores sont des cellules dormantes. Les membranes cellulaires des champignons phytopathogènes sont, comme pour la plupart de celles des êtres vivants, constituées de polymères de sucres, essentiellement du glucose, entrelacés d’acides gras et de stérols, ces polymères de sucres, des polysaccharides, servant d’architecture pour le maintien de l’intégrité de cet ensemble complexe. Au cours de la croissance du champignon ces membranes éclataient. La molécule fongicide devait donc interférer avec la synthèse de l’un ou l’autre des composants membranaires et très probablement les polysaccharides puisque aucun article n’avait fait mention d’une perturbation ni des acides gras, en particulier les phospholipides ni des stérols.

Un seul court article mentionnait enfin un déficit significatif de la teneur en acide ascorbique intracellulaire. Cette observation n’avait apparamment jamais attiré l’attention de qui que ce soit mais elle était pourtant la preuve que l’Iprodione agissait sur le métabolisme des sucres puisque l’acide ascorbique, plus connu sous le nom de vitamine C, est synthétisé à partir d’une forme phosphorylée du glucose particulière, le glucose-1-phosphate, nous allons y revenir. Toutes les voies de biosynthèse conduisant à des polymères du glucose comme par exemple le glycogène chez les animaux et y compris chez l’homme ou encore les polysaccharides membranaires comme chez le champignon sont issues de ce glucose-1-phosphate. Or tous les organismes vivants sont incapables d’ajouter directement un groupe phosphate en position 1 du glucose. Ce que la cellule sait faire c’est produire du glucose phosphorylé en position 6 puis à l’aide d’un enzyme particulier transférer ce phosphate de la position 6 à la position 1 car c’est thermodynamiquement moins dispendieux.

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J’avais donc intuitivement identifié la cible primaire de l’Iprodione mais encore fallait-il prouver que cette intuition était exacte. Et pour ce faire il fallait donc purifier l’enzyme en question, tâche à laquelle je me livrais en partant de cultures in vitro du champignon qui était heureusement coopératif puisqu’il était très aisé d’en obtenir des quantités suffisantes en quelques jours. En quelques 6 mois je réussis à isoler l’enzyme et en caractériser les paramètres cinétiques. Restait l’étape critique : essayer de voir quel effet l’Iprodione avait sur l’activité de cet enzyme appelé phosphoglucomutase. Hélas les premiers essais furent totalement négatifs. Peut-être que l’enzyme purifié ne se comportait pas à l’identique dans un milieu aqueux très simplifié en regard de la soupe complexe du cytoplasme d’une cellule ou qu’il devait être associé à d’autres éléments pour devenir sensible à l’Iprodione, bref, rédiger une publication au sujet de cette purification me paraissait trivial car je n’avais pas apporté de modifications innovantes dans les protocoles de purification du même enzyme à partir d’autres êtres vivants décrits dans la littérature.

Ma conviction était trop fortement ancrée dans mon cerveau pour abandonner et cet échec apparent eut lieu peu avant les vacances de fin d’année et je partis, je m’en souviens très bien, au sud du Sénégal avec mon dernier fils dans un petit hôtel situé dans le delta du Saloun. De retour au laboratoire je repris la solution d’Iprodione qui était restée sur la paillasse à la température ambiante et recommençais mon travail d’investigation et, Oh surprise ! « ma » phosphoglucomutase était cette fois totalement inhibée par des ajouts infimes de cette « vieille » solution d’Iprodione. Il n’y avait plus de doute, l’Iprodione inhibait donc bien cet enzyme et ce dernier pouvait être considéré comme la cible primaire du fongicide. Encore fallait-il le prouver.

J’étais confronté à un nouveau problème : identifier ce qui s’était passé en deux semaines au sein de cette solution dans du diméthylsulfoxyde abandonnée dans un coin de paillasse à la température ambiante et à la lumière. La démarche pouvait alors être d’identifier toutes les molécules issues de l’Iprodione qui avaient pu apparaître dans cette solution lors de processus complexes d’oxydation ou de dégradation spontanée ou bien de tester les unes après les autres toutes celles qui avaient été décrites dans la littérature relatives à la dégradation de la molécule initiale. Un tel processus dégradatif pouvait aussi exister dans des conditions réelles d’utilisation du fongicide soit à l’extérieur du champignon, soit à l’intérieur des cellules de ce dernier. Pour avoir une petite idée de ce qui avait pu se passer dans cette solution « vieillie » je fis une petite vérification en soumettant un échantillon à une analyse chromatographique dont le résultat pouvait être hasardeux dans la mesure où il était alors nécessaire de détecter d’éventuels produits secondaires dans l’ultra-violet lointain, technique qui pouvait prêter à confusion. Le résultat fut décevant car en dehors du pic de l’authentique fongicide il existait des dizaines d’autres entités en quantités infimes, autant dire chercher une aiguille dans une meule de foin.

Suite et fin (peut-être) dans le prochain épisode. Illustrations Wikipedia.

4 réflexions au sujet de « Quelques mémoires de ma carrière de chercheur en biologie (4) »

  1. Le récit est amusant, on croirait à un remake de la découverte de la pénicilline ^^

    J’ai lu il y a peu, bien que le domaine de votre métier me soit totalement hermétique, que le jus de rhubarbe présentait des avantages à l’acide ascorbique pour l’effet anti oxydant et la conservation de la nourriture. Mais bon, pour 5 fois plus cher

  2. @jacqueshenry :
    Une question au pif : aurait-on un lien quelconque, même lointain, avec la tautomérisation céto-ènolique de l’acide ascorbique ?

    • C’est lointain dans ma mémoire … Ce dont je me souviens est que l’acide ascorbique provient soit de la gulonolactone, soit de la galactolactone. Chez les microorganismes je crois me souvenir que c’est à partir de l’UDP-glucose qui ne peut provenir que du glucose-1-phosphate. L’homme ne possède par l’équipement nécessaire à la biosynthèse de l’acide ascorbique, la forme oxydée étant transformée en permanence en forme réduite appelée aussi ascorbate avec intervention de NADPH, mais je peux me tromper …

      • Ok merci. J’avais imaginé que les formes tautomères de l’acide ascorbique pouvaient moduler l’activité de la mutase, et que le fongicide pouvait agir sur cet équilibre dans un sens préférentiel mais ça ne doit pas être ça 🙂

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